CBRH7919大鼠肝癌細(xì)胞

目的體外觀(guān)察大鼠CBRH-7919肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化及其機(jī)制。方法分離Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,鑒定后構(gòu)建BMSC與肝癌細(xì)胞的共培養(yǎng)模型,分3組:共培養(yǎng)組、單獨(dú)BMSC組及含有抗VEGF抗體的共培養(yǎng)組,48 h和72 h后,免疫熒光法檢測(cè)VEGFR2和CD31的表達(dá),半固體培養(yǎng)基檢測(cè)毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成。結(jié)果 BMSC表型鑒定為CD29+/CD44+/CD45-/CD34-,48 h后,共培養(yǎng)組BMSC少量表達(dá)CD31和VEGFR2,陽(yáng)性率分別為(11.50±1.87)%和(12.33±1.37)%,且出現(xiàn)毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)(8.00±0.05),72 h后,共培養(yǎng)組CD31和VEGFR2表達(dá)明顯增多,陽(yáng)性率分別為(24.43±2.23)%和(24.86±0.69)%,毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)也明顯增加(22.00±0.02),而單獨(dú)BMSC組和含有抗VEGF抗體的共培養(yǎng)組均陰性。結(jié)論血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在大鼠CBRH-7919肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。

CBRH7919大鼠肝癌細(xì)胞

1)培養(yǎng)瓶有破裂，培養(yǎng)液有漏液：細(xì)胞極大可能會(huì)污染，所以我們會(huì)及時(shí)安排幫老師解決；2)細(xì)胞漂浮：培養(yǎng)瓶不開(kāi)封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。次日觀(guān)察，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底，表明細(xì)胞活力正常，剩余漂浮的細(xì)胞可以離心去掉，留10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)觀(guān)察，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%，進(jìn)行消化傳代；如細(xì)胞還是不貼壁，將細(xì)胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀(guān)察，我們的技術(shù)人員會(huì)一直跟蹤指導(dǎo)，直到問(wèn)題解決；3)對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的貼壁細(xì)胞：可采用適當(dāng)?shù)奶岣吲囵B(yǎng)基中血清濃度，或隔日換液的方法來(lái)保證細(xì)胞的狀態(tài)和生長(zhǎng)速度；4)對(duì)于生長(zhǎng)不均的貼壁細(xì)胞：在培養(yǎng)過(guò)程中若出現(xiàn)細(xì)胞分布明顯不均時(shí)(即某一區(qū)域細(xì)胞已重疊生長(zhǎng)，而旁邊則為一塊空白)，此時(shí)可將細(xì)胞進(jìn)行消化，重新打散，貼壁，加入新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
細(xì)胞物種來(lái)源：人源或鼠源等其它物種來(lái)源
細(xì)胞傳代方法：1：2-1：3傳代；每周換液2-3次。
細(xì)胞傳代注意事項(xiàng)：①傳代培養(yǎng)時(shí)注意無(wú)菌操作并防止細(xì)胞間的交叉污染。所有操作盡量靠近酒精燈火焰。每次進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每種細(xì)胞使用一套器材；②每天觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿(mǎn)，折光性好，生長(zhǎng)致密時(shí)即可傳代；③如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，應(yīng)立即采取措施，一般應(yīng)棄置污染的細(xì)胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BBS或培養(yǎng)基反復(fù)清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗生素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基。傳代細(xì)胞的建系和維持：細(xì)胞系的維持通過(guò)換液傳代再換液、再傳代和細(xì)胞種子凍存來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)每一個(gè)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)都有其自身的特點(diǎn)，要做好建系的維持必須記錄好細(xì)胞檔案,換液傳代和做好細(xì)胞系的管理工作。培養(yǎng)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇：細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中，儲(chǔ)存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。

細(xì)胞凍存的步驟：1)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天換液。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)；2)去上清液，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無(wú)菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，細(xì)胞濃度為5×106～1×107/mL之間。(凍存培養(yǎng)液的配置是不是一定要用小牛血清呢？答案是不一定的，具體要看培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型來(lái)選擇；3)將分裝上述細(xì)胞懸液于2ml凍存管中，每管0.25ml。凍存管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細(xì)胞名稱(chēng)和凍存日期，同時(shí)作好登記(日期、細(xì)胞種類(lèi)及代次、凍存支數(shù))；4)將裝好細(xì)胞的凍存管放到凍存盒中，-80℃冰箱過(guò)夜。；如果有程序降溫器(放在-80℃冰箱過(guò)夜，放入液氮罐);或者可以在4℃，2h;然后轉(zhuǎn)到-20℃，2h;-80℃，2h;放入液氮罐；5)細(xì)胞凍存在液氮中可以長(zhǎng)期保存，但為妥善起見(jiàn)，凍存半年后，取出一只凍存管細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀(guān)察生長(zhǎng)情況，然后再繼續(xù)凍存。