懸浮細(xì)胞的傳代

              懸浮細(xì)胞傳代比貼壁細(xì)胞傳代稍微簡(jiǎn)單一些。由于細(xì)胞已經(jīng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的懸浮，因此無(wú)需通過(guò)酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離，整個(gè)過(guò)程較為迅速，對(duì)細(xì)胞的損傷也較小。懸浮培養(yǎng)時(shí)不進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)基的更換；而是每2到3天加料一次，直到細(xì)胞匯合?？梢灾苯釉谂囵B(yǎng)瓶中稀釋細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，或者也可以從培養(yǎng)瓶中取出一部分細(xì)胞，將余下的細(xì)胞稀釋到該細(xì)胞系適宜的接種密度。懸浮細(xì)胞的傳代后的延滯期一般比貼壁細(xì)胞要短。

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)容器

              懸浮培養(yǎng)可采用未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的無(wú)菌培養(yǎng)瓶（例如：不嗲折流板的搖瓶）進(jìn)行；但是，專為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)瓶（攪拌瓶）具有出色的氣體交換功能，可進(jìn)行較大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。

             轉(zhuǎn)瓶有兩種基本設(shè)計(jì)；其培養(yǎng)基由懸掛的攪拌棒或者垂直的葉輪攪拌（即攪動(dòng)）。垂直葉輪的換氣效果更佳。轉(zhuǎn)瓶總培養(yǎng)體積不能超過(guò)轉(zhuǎn)瓶標(biāo)示體積的一半，以便換氣充分（例如：500ml轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)液體不能超過(guò)250ml）。  

所需材料     

1. 裝有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)容器
2.  不帶折流板的搖瓶或者轉(zhuǎn)瓶
3. *生長(zhǎng)培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃
4. 37℃培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為5％的濕化空氣
5. 磁力攪拌盤(pán)（如果使用轉(zhuǎn)瓶）、滾架（如果使用滾瓶）或者搖床（如果使用傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿）
6. 用于活細(xì)胞和總細(xì)胞計(jì)數(shù)的試劑和設(shè)備（例如：countess™||自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、臺(tái)盼藍(lán)染料或血球計(jì)數(shù)器。）

懸浮細(xì)胞傳代流程

             所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無(wú)菌狀態(tài)。必須采用正確的無(wú)菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行。達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)聚集成團(tuán)塊，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)培養(yǎng)基會(huì)變得渾濁。傳代前所建議的大細(xì)胞密度隨細(xì)胞系不同而有所差異。

            使用搖瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)

                                   以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了利用振蕩培養(yǎng)箱和搖瓶進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)傳代的一般流程。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，必須參閱針對(duì)具體的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

注：應(yīng)確保搖瓶中無(wú)折流板（即：位于培養(yǎng)瓶底部用于攪動(dòng)的齒形板），因?yàn)檎哿靼鍟?huì)破壞搖動(dòng)節(jié)奏。

1. 當(dāng)細(xì)胞適合傳代（即：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期未達(dá)到匯合狀態(tài)）時(shí)，從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶，使用無(wú)菌吸管從培養(yǎng)瓶中取出少量細(xì)胞樣品。如果吸取樣品前細(xì)胞已經(jīng)沉淀，應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中均勻分布。
2. 通過(guò)此樣品，采用countess™||自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或者血球計(jì)數(shù)器、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀按照臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比。
3. 計(jì)算將細(xì)胞稀釋到推薦接種密度時(shí)需要加入的培養(yǎng)基體積
4. 在無(wú)菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中。必要時(shí)可將培養(yǎng)的細(xì)胞分到多個(gè)培養(yǎng)瓶中。
5. 將培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋開(kāi)一圈，以便進(jìn)行充分的氣體交換（或者使用透氣性瓶蓋），并將培養(yǎng)瓶放回振蕩培養(yǎng)箱。搖晃速度取決于具體的細(xì)胞系。

      注：為了盡量減少細(xì)胞碎片和無(wú)用的代謝副產(chǎn)物在振蕩培養(yǎng)體系中蓄積，每三周（或者必要時(shí)）應(yīng)將細(xì)胞懸液輕輕離心一次，離心力為100×g，時(shí)間為5-10分鐘，然后用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。

       使用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)

 以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了利用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)傳代的一般流程。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，必須參閱針對(duì)具體的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

     請(qǐng)注意細(xì)胞對(duì)物理剪切作用很敏感。應(yīng)確保葉輪可自由轉(zhuǎn)動(dòng)，不會(huì)觸碰到容器壁或底部。葉片頂部應(yīng)稍微高于培養(yǎng)基。以確保培養(yǎng)系統(tǒng)換氣充分。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)動(dòng)裝置，使葉片不會(huì)觸碰容器和底部。下表列出了不同尺寸轉(zhuǎn)瓶所需的小培養(yǎng)基體積。

我們建議開(kāi)始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)瓶容器不要超過(guò)500ml。建議從方法成熟、體積較小的轉(zhuǎn)瓶開(kāi)始逐步擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模。

1. 當(dāng)細(xì)胞適合傳代（即：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期而未達(dá)到匯合狀態(tài)）時(shí)，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，使用無(wú)菌吸管從培養(yǎng)瓶中取出少量細(xì)胞樣品。如果吸取樣品前細(xì)胞已經(jīng)沉淀，應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中均勻分布。
2. 通過(guò)此樣品，采用countess™||自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或者血球計(jì)數(shù)器、細(xì)胞技術(shù)儀按照臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定總細(xì)胞和活細(xì)胞百分比。
3. 計(jì)算將細(xì)胞稀釋到推薦接種密度時(shí)需要加入的培養(yǎng)基體積
4. 在無(wú)菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中。必要時(shí)可將培養(yǎng)的細(xì)胞分到多個(gè)培養(yǎng)瓶中
5. 將培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋開(kāi)一圈，以便進(jìn)行充分的氣體交換，并將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)速取決于所用細(xì)胞系和葉輪類型。應(yīng)確保轉(zhuǎn)速始終在推薦值范圍內(nèi)，以免剪切應(yīng)力導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

注：為了盡量減少細(xì)胞碎片和無(wú)用的代謝副產(chǎn)物在振蕩培養(yǎng)體系中蓄積，每三周（或者必要時(shí)）應(yīng)將細(xì)胞懸液輕輕離心一次，離心力為100×g，時(shí)間為5-10分鐘，然后用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。

懸浮昆蟲(chóng)細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)

                     雖然昆蟲(chóng)細(xì)胞傳代的一般步驟與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相同，但是這些培養(yǎng)系統(tǒng)的一些關(guān)鍵要求有所不同。為了獲得滿意結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中必須嚴(yán)格遵守所用昆蟲(chóng)細(xì)胞系附帶的操作說(shuō)明。

1. 進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)無(wú)需更換培養(yǎng)基。定期傳代時(shí)需要吸出細(xì)胞懸液，然后加入適量培養(yǎng)基，將細(xì)胞稀釋到適當(dāng)密度。添加新鮮培養(yǎng)基后可使細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素達(dá)到*補(bǔ)充。
2. 培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)建議不要用二氧化碳交換。
3. 昆蟲(chóng)細(xì)胞應(yīng)于27℃、非濕化環(huán)境中培養(yǎng)?？蓪⒓?xì)胞放在操作臺(tái)上或者放入抽屜中于室溫下培養(yǎng)。但是，建議使用溫度控制在27℃的環(huán)境。
4. 使用昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
5. 使用表面活性劑降低剪切作用。進(jìn)行昆蟲(chóng)細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時(shí)建議使用0.1％pluronic™。F-68pluronic™ F-68（BASF)是一種表面活性，可降低葉輪導(dǎo)致的細(xì)胞膜剪切作用 注：sf-900||SFM和expressFive™ SFM中已經(jīng)含有表面活性劑。
6. 某些昆蟲(chóng)細(xì)胞可能需要一定的過(guò)程來(lái)適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。更多信息，請(qǐng)參閱針對(duì)具體細(xì)胞的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)或操作手冊(cè)。
7. PS:仟諾生物，您身邊的細(xì)胞生物學(xué)專家，如需相關(guān)產(chǎn)品，敬請(qǐng)電聯(lián)!!